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近日，清華大學(xué)精密儀器系尤政教授團(tuán)隊(duì)提出了基于點(diǎn)陣激光激發(fā)方法的高通量流式成像方法。該方法可實(shí)現(xiàn)低成本、高可擴(kuò)展性的成像流式細(xì)胞儀，而且首次驗(yàn)證了全光譜成像流式技術(shù)。相關(guān)成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”為題在期刊《Device》上發(fā)表，并被選為當(dāng)期封面文章。

研究背景與成果

流式和顯微鏡是細(xì)胞檢測(cè)的兩個(gè)基本工具。流式技術(shù)具有高通量和豐富的分子檢測(cè)信息，但缺乏細(xì)胞形態(tài)信息；相反，熒光顯微鏡可以提供細(xì)胞影像信息，但檢測(cè)通量低，難以獲取足夠的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。自流式細(xì)胞儀問(wèn)世以來(lái)，其發(fā)展趨勢(shì)一直在于保持高檢測(cè)通量的同時(shí)增加更多信息維度，例如空間形態(tài)信息或光譜信息，以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞分析或分選。成像流式技術(shù)是一種整合了流式細(xì)胞儀高檢測(cè)通量和熒光顯微鏡空間分辨能力的儀器。然而，由于成像通量、分辨率和檢測(cè)靈敏度之間的基本矛盾，現(xiàn)有的成像流式技術(shù)通常采用復(fù)雜的光路系統(tǒng)、復(fù)雜的圖像重構(gòu)算法，同時(shí)成像可擴(kuò)展性也很有限。這使得成像流式細(xì)胞儀難以達(dá)到像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀那樣的高檢測(cè)通道數(shù)，并且其高昂的技術(shù)成本限制了應(yīng)用范圍。

為解決這些問(wèn)題，清華大學(xué)精儀系尤政教授課題組提出了一種基于點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。該方法的核心思想是使用點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)光斑替代傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀中的橢圓或條狀光斑，從而賦予流式細(xì)胞儀成像能力。

圖1：點(diǎn)陣激光激發(fā)成像原理示意圖

圖1展示了該成像方法的工作原理。在檢測(cè)區(qū)域中，激發(fā)光斑呈一串等間隔的點(diǎn)陣光斑，由衍射光學(xué)器件生成，光斑間隔大于細(xì)胞大小，并且其排列直線與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)直線呈一定的小角度。當(dāng)細(xì)胞依次通過(guò)照明光斑時(shí)，將產(chǎn)生一串熒光和散射光信號(hào)。在圖像重構(gòu)階段，只需通過(guò)信號(hào)的分割和重組即可重建細(xì)胞圖像。該方法具有實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)重建的優(yōu)勢(shì)，并且與現(xiàn)有流式細(xì)胞儀光路結(jié)構(gòu)兼容，因此具有良好的可擴(kuò)展性，能夠在高檢測(cè)通量的基礎(chǔ)上，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多激光、多熒光通道以及無(wú)標(biāo)記成像。

技術(shù)成果展示

圖2. 雙激光五通道成像流式系統(tǒng)

圖3.細(xì)胞器進(jìn)行成像與細(xì)胞周期研究

本研究利用基于LASE成像方法構(gòu)建了一個(gè)成像系統(tǒng)，具備2色激光（488nm/638nm）和5個(gè)成像通道（明場(chǎng)、FITC、PE、PI、APC），如圖2A所示。該系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)證在30×30μm的成像視場(chǎng)下，具有1.3μm的空間分辨率。當(dāng)細(xì)胞樣本以5m/s的流速經(jīng)過(guò)探測(cè)區(qū)域后，系統(tǒng)能夠進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的明場(chǎng)成像和熒光成像，且不會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)模糊，成像通量最高可達(dá)每秒5000個(gè)細(xì)胞每秒。該系統(tǒng)不僅能夠?qū)?xì)胞中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像（見(jiàn)圖3A），而且可以在多個(gè)熒光波段下，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)成像（見(jiàn)圖3B）。在生物學(xué)應(yīng)用中，圖像被廣泛視為金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗軌驗(yàn)榧?xì)胞分析提供更為豐富和準(zhǔn)確的信息，從而更細(xì)致準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞分型。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)圖像，可以在傳統(tǒng)流式基礎(chǔ)上更進(jìn)一步區(qū)分細(xì)胞周期M期的細(xì)胞核形態(tài)，如圖3C所示。

圖4. 32通道全光譜成像流式驗(yàn)證

得益于LASE成像方法的高度可擴(kuò)展性，本論文將成像熒光信號(hào)引入一個(gè)基于棱鏡色散的32通道光譜儀中，初步驗(yàn)證了全光譜成像流式細(xì)胞儀的可行性。該系統(tǒng)在保持每秒5000個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)速度通量的同時(shí)，能夠同時(shí)在32個(gè)光譜通道上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。借助光譜分解算法，可以有效解決多染料檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中染料光譜混疊效應(yīng)的問(wèn)題，將成像流式細(xì)胞儀的理論可檢測(cè)染料數(shù)擴(kuò)展至30以上的量級(jí)。這將大大提高成像流式細(xì)胞儀給單細(xì)胞分析帶來(lái)的信息量。

成果優(yōu)勢(shì)

該研究提出的點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法，具有以下優(yōu)勢(shì)：

1、系統(tǒng)簡(jiǎn)單：采用衍射器件在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)上進(jìn)行光斑整形，即可實(shí)現(xiàn)高通量成像功能，相較于已有成像流式技術(shù)，具備顯著的成本優(yōu)勢(shì)。

2、圖像重建復(fù)雜度低：可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)重建，進(jìn)一步可用于基于圖像的實(shí)時(shí)細(xì)胞分選。

3、可擴(kuò)展性強(qiáng)：該技術(shù)可搭配多個(gè)激光和更多的檢測(cè)通道，也可結(jié)合光譜檢測(cè)實(shí)現(xiàn)全光譜成像，使成像流式細(xì)胞儀達(dá)到與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀和光譜流式細(xì)胞儀相當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)標(biāo)記數(shù)量。

該技術(shù)提供的高通量和信息量將有效為細(xì)胞病理學(xué)、多組學(xué)、藥物篩選、液體活檢、單細(xì)胞測(cè)序等研究領(lǐng)域提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

該研究的第一完成單位為清華大學(xué)精密儀器系。中國(guó)工程院院士、清華大學(xué)精密儀器系教授尤政，斯坦福大學(xué)研究科學(xué)家趙精晶(原精儀系博士生）為該論文的共同通訊作者。精儀系博士畢業(yè)生韓勇、趙精晶為該文的共同第一作者。精儀系博士畢業(yè)生晁子翕、焦?jié)珊?，精儀系博士生張馳、姜凌奇等為該論文共同作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)及儀器北京實(shí)驗(yàn)室的資助。

論文鏈接：

https://www.cell.com/device/fulltext/S2666-9986(23)00183-7#secsectitle0070